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Editing genetico: la tecnologia CRISPR/CAS9

CRISPR CAS9 essenziali nel sistema immunitario dei batteri, permettono di riconoscere ed eliminare materiale genetico estraneo.

Da sempre la possibilità di modificare in maniera estremamente precisa ed efficiente il DNA delle cellule di un organismo è stata una delle sfide principali affrontate della biologia molecolare mo-derna. Diverse sono state le tecniche proposte nel corso degli anni, ma un grande traguardo sembra essere stato raggiunto con la tecnologia denominata CRISPR/Cas9, che rappresenta l’acronimo per l’enzima prodotto dal gene Cas9 e i ClusteredRegularlyInterspaced Short PalindromicRepeats, ossia le ripetizioni palindromiche di gruppi di DNA estraneo disposti ad intervalli regolari fra loro. In questo articolo vorrei mostrarvi il funzionamento di questo sistema, le sue immense applicazioni e le controversie a riguardo. Sembra non esserci correlazione con i primi due articoli di questa piccola serie riguardante la nascita e l’estinzione delle specie viventi, ma alla fine tutto dovrebbe esservi più chiaro sul perché questa tecnologia si inserisce bene nel discorso.

La biologia della CRISPR/Cas9

Il funzionamento dei CRISPR e dei geni Cas è essenziale nel sistema immunitario dei batteri, in quanto permettono a questi piccoli organismi di riconoscere ed eliminare materiale genetico estra-neo, principalmente di origine virale. Il sistema è stato per la prima volta evidenziato negli anni ’80 in E.coli, ma la sua funzione è stata confermata dagli studi effettuati nel 2007 da Barrangou e colleghi, che hanno dimostrato come il batterio S.thermophilus poteva acquisire resistenza a determinati batteriofagi (virus che infettano i batteri) integrando frammenti del genoma virale all’interno delle sue sequenze CRISPR. In seguito all’inserimento, il DNA viene trascritto e porta alla formazione di crRNA (CRISPR RNA), ossia delle piccole sequenze di RNA che sono utilizzate come guide che conducono gli enzimi Cas, che funzionano da endonucleasi, verso il DNA da eliminare. Per chi di voi si dovesse chiedere in cosa consista una endonucleasi, non è altro che un enzima in grado di tagliare il DNA a livello di specifiche sequenze.

 


Come vedete dalla figura, però, il sistema ha bisogno anche di un’altra componente per poter fun-zionare in maniera corretta, rappresentata dal tracrRNA (trans-activatingcrRNA), ossia un altro piccolo frammento di RNA parzialmente complementare al crRNA che è responsabile della corretta “maturazione” del crRNA, necessaria per poter raggiungere il suo corretto funzionamento.

L’uso della CRISPR/Cas9 in biologia molecolare.

Una volta descritto da dove derivi la tecnologia della CRISPR/Cas9, cerchiamo di capire che cosa possiamo effettivamente farne nell’ambito della biologia molecolare. Innanzitutto, sottolineiamo fin da subito che questa tecnica, rispetto a quelle precedenti che ambiscono allo stesso obbiettivo, migliora l’efficienza nella modifica del DNA e riduce anche il problema delle mutazioni off-target, ossia quelle possibili mutazioni del DNA che si verificano in zone non previste e non desiderate.

La figura riassume quelle che sono le possibili e principali applicazioni della CRISPR/Cas9. Da notare fin da subito che in nessuna delle immagini compaiono il crRNA e il tracrRNA che abbiamo nominato in precedenza. Questo perché grazie al lavoro svolto nel 2012 dai gruppi di ricerca di Doudna e Charpentier è stato possibile combinare queste due componenti in un’unica molecola rappresentata dal sgRNA (synthetic single guide RNA) che ben svolge entrambe le funzioni.

Nel primo caso, comunque, la tecnica viene sfruttata per indurre mutazioni su entrambi i filamenti del DNA in un ben preciso punto del genoma, andando ad introdurre ovviamente anche il frammento di DNA donatore che desideriamo inserire nella cellula da modificare.

Nel secondo caso, l’unica differenza consiste nel fatto che la mutazione viene indotta solo su un filamento di DNA; il che potrebbe essere utile nelle situazioni in cui il problema da risolvere non riguarda entrambi i filamenti della doppia elica.

Nell’ultimo caso, infine, il sistema CRISPR/Cas9 è stato modificato di modo da non tagliare il DNA bersaglio. Questo sembra andare contro quello che è stato detto fino a questo momento per tutto l’articolo, ma in realtà mostra un’altra valida applicazione della tecnica, perché, legando alla Cas un qualsiasi altro dominio proteico, è possibile indurre l’attivazione o il silenziamento di geni posti nelle vicinanze della sequenza bersaglio oppure segnalare la presenza del gene di interesse associando, sempre al nostro enzima, la proteina GFP, ossia una sorta di “etichetta fluorescente” che grazie alla colorazione verde ci permette di affermare con certezza la presenza della sequenza di DNA che stavamo cercando nel nostro esperimento.

Le applicazioni della tecnologia CRISPR/Cas9

Come avete appena visto, quindi, la tecnologia CRISPR/Cas9 si mostra estremamente versatile perché può essere sfruttata in vario modo dai biologi molecolari. Ma una volta compreso questo, come è possibile applicarla ai nostri studi? Ebbene, la tecnica sta trovando negli ultimi anni innumerevoli campi di applicazione nell’indurre modifiche del DNA nei più svariati organismi e per il trattamento delle più importanti patologie. Per citare alcuni esempi, nell’Università di Washington, la tecnica CRISPR/Cas9 è stata utilizzata per correggere il difetto genetico all’origine della distrofia muscolare di Duchenne nei roditori (un buon modello animale per gli studi della patologia che affligge anche noi esseri umani).

Tale patologia, infatti, è dovuta alla mutazione di un gene che si trova sul cromosoma X e si presta bene al trattamento basato sulla CRISPR/Cas9; i ricercatori, infatti, inserendo un frammento di DNA non mutato mediante un vettore virale, sono riusciti ad ottenere fino al 70% dei livelli normali di distrofina nei muscoli, consentendo un miglioramento della funzionalità dei tessuti sia nel cuore che nei muscoli scheletrici. L’obiettivo dei ricercatori è arrivare a una tecnica talmente sofisticata e maneggevole da consentire un uso terapeutico anche nell’uomo. La strada, però, è davvero lunga perché in molti casi correggere difetti genetici può non essere così semplice, soprattutto se il gene coinvolto non è solamente uno.

I primi successi sono stati ottenuti anche sugli embrioni umani grazie al lavoro svolto da un gruppo di ricercatori cinesi. In questo studio sono state usate cellule uovo normali ma immature (solitamente scartate dalle cliniche di fecondazione in vitro perché hanno un tasso di successo molto basso), che sono state fecondate con lo sperma di due donatori portatori di due mutazioni genetiche. Il primo era portare di una mutazione nell’enzima G6PD, che provoca una forma particolare di favismo molto diffusa in Cina; mentre l’altro portava una delle mutazioni responsabili della comparsa della beta-talassemia. In entrambi i casi, alcuni embrioni hanno visto correggere la mutazione in tutte le cellule di cui erano composti, mentre in altri casi sono comparsi i cosiddetti “embrioni a mosaico”, dove alcune cellule sono state modificate ed altre no.

Per rendere più sicuro l’uso della CRISPR/Cas9 nella correzione delle mutazioni genetiche dannose, quindi, c’è bisogno di fare ancora molta strada. Va detto, però, che il mosaicismo po-trebbe essere evitato modificando direttamente il genoma di spermatozoi e cellule uovo e che comunque non rappresenterebbe necessariamente un problema, visto che in alcune malattie basterebbe recuperare anche una funzionalità di una percentuale di cellule inferiore al 100%.

Le controversie nella tecniche CRISPR/Cas9

Soprattutto l’ultimo esempio citato nelle applicazioni della tecnica introduce a quella che è l’ultima parte dell’articolo, ossia le possibili problematiche che possono e stanno già nascendo riguardo la regolamentazione nell’uso di questa tecnica. Se si è compreso il funzionamento della tecnologia descritta fino a questo momento, vi renderete conto da soli che le potenzialità possono essere davvero straordinarie, perché un suo perfezionamento permetterebbe di modificare gli embrioni a proprio piacimento intervenendo quindi su qualsiasi aspetto considerato “anormale” o “sbagliato” di modo da creare individui scientificamente “corretti”.

Sorge quindi un problema dal punto di vista etico. E’ giusto portare avanti gli studi su questa tecnica ampliandone sempre di più i campi di applicazione oppure è meglio limitarne la diffusione? Potenzialmente, infatti, se la CRISPR/Cas9 viene applicata sulle cellule germinali di un organismo oppure a livello embrionale, la modifica che noi stiamo inserendo diventerebbe automaticamente ereditaria, portando quindi alla diffusione di un qualcosa che in un primo momento potrebbe essere considerato positivo, ma che in futuro potrebbe svelare degli aspetti negativi. L’idea di poter modificare a proprio piacimento qualsiasi essere vivente fin dalla sua nascita è per certi versi affascinante e spaventosa allo stesso momento. La scienza sta facendo e continuerà a fare passi da gigante e, per esprimere un mio personale punto di vista, sarebbe sciocco bloccarne o limitarne i campi di applicazione.

È giusto quindi pensare a delle leggi che sicuramente vadano ad evitare ciò che dalla maggior parte di noi è considerato eticamente scorretto, ma non escludere del tutto dei possibili campi di applicazione che potrebbero portare a dei risultati importanti per il progresso della nostra specie. L’argomento, quindi, è veramente complesso e si potrebbe disquisire per giorni a riguardo. Mi auguro solamente che l’articolo vi porti a porvi alcune domande riguardo la tecnica CRISPR/Cas9 e a come questa potrebbe modificare il nostro futuro. Ah… se vi stavate chiedendo perché questa tecnica è legata al discorso riguardo alla nascita e all’estinzione di una specie, sappiate che uno dei campi di applicazione è rappresentato da quella che è stata chiamata de-estinzione degli organismi. Ma questo sarà oggetto del prossimo articolo.

 

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